2017年5月30日,《自然-方法》上發表了一篇通訊文章提示了以CISPR為基礎的基因編輯技術在實際應用中還需要更為審慎。CRISPR-CAS技術由于可以對基因的特定位點進行修改和更替,人們稱之為“基因魔剪”。在研究領域,人們把這項技術應用在對農作物、經濟動物進行基因編輯。如果能夠以高特異性的方式,只對致病基因進行修改,這項技術可以用來對已獲得致病基因的患者進行治療,徹底消除致病基因,實現對基因病、罕見病的治療。在這篇文章中,作者通過基因編輯技術,在老鼠身上實現了對致病基因的修改。但是通過對兩只經過修改后的基因信息進仔細檢視后發現,經過基因編輯后,小鼠的基因序列出現了額外的變化。這些變化看來不是小鼠自然發生的,而可能是由基因編輯系統產生的。通過CRISPR基因編輯的小鼠,出現了數百個意想不到的設計之外的突變,如果這種現象出現在接受治療的病人身上,治療的效果就變得不可評價。但是,這種情況可能只限于實驗的技術和條件的特殊性。CRISPR技術的發展一直是以提高修盡管序列的特異性為目標的。

“由于論文提供的實驗證據有限,目前還不能得出CRISPR/Cas9具有更大安全隱患的結論。”中國科學院生物物理研究所研究員劉光慧對澎湃新聞(www.thepaper.cn)表示。

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佳學基因首席科學家黃家學博士認為,基因編輯技術產生和應用的早期出現一些還不完全滿意的地方是正常的,但這并不否認其他科學家采用同樣的技術、經過嚴格的控制使這技術降低脫靶現象,使基因編輯技術達到臨床應用的技術指標。其他實驗室、科研機構的不足恰恰是我們學習的源泉和前進發展的機會。這篇文章提出了一個基因矯正技術的優勢,就是該實驗采用的脫靶位點的模擬計算方法需要進行改進。因為通過已有的計算方法得到的有可能出現的脫靶位點,在實際中并沒有出現。兩只經過基因矯正的小鼠卻有超過70%的脫靶序列是相同的。這說明,脫靶位點并不是隨機的。通過對脫靶位點及所采用的導向RNA的選擇分析,可以改善對脫靶的預測。基因矯正的第一個可以實現的目標不是完全消除脫靶現象,而是讓脫靶現象不要產生致命的危害。

經過鋅指蛋白和TALEN兩代基因編輯技術之后,借用自然界規律的后起之秀CRISPR因為技術門檻低、效率高,成為目前全球實驗室最為常用的基因編輯技術。CRISPR的中文全稱是“成簇的規律間隔的短回文重復序列”,使用的是細菌免疫系統應對噬菌體的特殊機制,在向導RNA的引導下,Cas9蛋白可對特定的DNA序列進行切割,實現替換。這一技術為消除導致疾病發生的基因提供了可能。在實驗動物身上,已經實現了對致病基因矯正。一項先進技術在動物身上的成功,是在人身上進行使用的前夜。推進這一步發生的是技術的成熟和穩健,再就是臨床治療的需求轉分為創新的動力。

基因編輯領域到底發生了什么?

在2017年5月30日在線發表于《自然-方法》的通訊文章中,研究人員表示,通過CRISPR基因編輯技術,他們將兩只盲鼠的致盲基因進行修復。

修復后,通過全基因組測序,他們發現,與未經過CRISPR編輯的小鼠相比,兩只經過改造的小鼠發生了100多個基因片段的插入或缺失(indel)、上千個單核苷酸突變(SNV)。其中,有117個基因片段缺失或插入和1397個單核苷酸突變是兩只盲鼠共有的。研究人員認為,這可能是因為CRISPR編輯目標致盲基因時出現了脫靶現象。兩只小鼠具有共同的脫靶位點,說明脫靶現象不是隨機的。

基因編輯的脫靶問題并不是一個新事物,就算第三代基因編輯技術、有“基因魔剪”之稱的CRISPR也沒有完全避免。所謂脫靶,指的是基因編輯工具工作時,可能“傷及無辜”,除了人們想改變的目標基因外,無意中改變了其他基因。

自從CRISPR系統問世以來,科學家們不斷在提高CRISPR系統的特異性,減少脫靶現象。目前,通過計算機模擬程序,實驗室里的科學家可以預測基因組中可能的脫靶位點,并重點檢查模擬結果中最可能脫靶的幾個區域。但是在本研究中,模擬計算得出的前50個脫靶區域實際上并沒有發生脫靶。這提出了改進脫靶序列模擬的要求。臨床應用時,使用全基因組測序的方法來檢測體內編輯后是否有脫靶導致的突變應當成為一個標準。“在應用于人的臨床治療時,基因編輯、基因矯正的結果必須經過單克隆細胞篩選、全基因序列測序驗證后,才能用于局部器官功能的修復治療實驗。在檢查時,一定要先進行腫瘤基因解碼,消除編輯后引入的腫瘤驅動基因。”黃家學博士介紹說。

同行為什么認為結論可信度不高?

首先是研究的樣本量。“樣本量太少,無法區分‘突變’的來源,是這個研究的最主要問題。”李偉說。作為一篇簡短的通訊文章,研究人員所用來得出結論的數據僅來自兩只實驗鼠和一只對照鼠。“但是考慮到整個研究過程的復雜性和工作量,這種數據是有重大價值的。",黃家學博士對此解釋到。

在劉光慧看來,缺乏合適的實驗對照也使得該研究可能流于“個性”。該研究僅僅使用了1只非注射組小鼠作為對照,嚴格的實驗設計應該包含更多的對照以排除不同小鼠之間固有的遺傳差異。他表示,即便在同一組織內,細胞和細胞之間在基因序列上也可能存在著一定的差異(即異質性);這些個體、組織、細胞之間的差異需要謹慎地排除,不能簡單將其歸因為基因編輯所致的突變。

楊輝和劉光慧在實驗對照組的設計改進上提出了類似的看法:為了嚴謹性和科學性,一方面,該研究應該同時包含基因編輯小鼠的父母系作為測序的對照,這樣可以部分確認突變是來自遺傳還是因為基因編輯。另一方面,由于CRISPR的工作機制是在向導RNA的帶領下找到目標基因,再用Cas9“剪刀”進行切割。該研究應該補充分別單獨注入向導RNA和Cas9的對照實驗,從而判斷是否突變真的是由于CRISPR切割所造成的脫靶效應。

此外,值得注意的是,基因尤其是單核苷酸的突變在自然界無時無刻不發生著,這意味著研究人員需要排除突變是不是自然發生的。“突變本來就會在DNA復制和細胞分裂的過程中自然發生,因此他觀察到的突變有多少是由CRISPR引發的脫靶,是否廣泛存在,仍然需要其他同行的驗證。”李偉說。

利用全基因組測序的方法來評估基因編輯工具的脫靶效應,這是該通訊文章的創新之處,但劉光慧有他的擔憂。

“在技術層面上,目前的全基因組測序會不可避免地報告少數‘假陽性’的突變結果,這些結果需要后續用生物信息學和Sanger測序等手段進一步‘過濾’和確證,才能最終得到確鑿的結論。”劉光慧向澎湃新聞解釋,理論上CRISPR/Cas9產生的大多數突變更有可能是插入缺失突變(indel),而該研究顯示單核苷酸變異(SNV)似乎比插入缺失突變(indel)還要多,這些不尋常的現象需要格外加以關注。

總而言之,研究人員通過全基因組測序發現了以數百計的突變,然而,要將這些直觀的“突變”與CRISPR的脫靶效應關聯起來,建立確鑿的因果關系,需要層層地排除其他可能性,方可定論。但目前,根據該通訊文章所呈現的實驗設計、數據,諸多可能性尚無法排除。這也是劉光慧、李偉、楊輝為這篇通訊文章打上的最大問號。

但長期從事科研和產業化的黃家學博士認為,盡管從科研的嚴謹性上,這篇文章的結論有待商榷。在實際中,我們分析了大量的人的全基因組序列,每一個正常的人都會有數百萬的插入缺失突變和單核苷酸變異。重要的不是變異的數量有多少,而是這些變化到底對實驗動物的影響是怎樣的。對這些變異序列的生物功能解碼至關重要。而同基因編輯之前的基因序進行比較,明確這些基因序列變化的來源則是至關重要的。

科學家怎么看基因編輯的安全性爭議?

對于基因編輯這一革命性的生物技術,安全性總是敏感地橫亙在大眾心頭。此次《自然-方法》的通訊文章掀起波瀾,讓CRISPR技術相關的上市生物公司股價受到波動。

“在更多證據出來之前,我們既不能輕率地說CRISPR/Cas9有嚴重缺陷或是《自然-方法》登錯了文章。”盡管對該通訊論文所得結論暫時保留意見,楊輝和唐騁表示:“CRISPR/Cas9作為一種對人類未來命運休戚相關的重要生物技術,一些謹慎的聲音總是很有意義的。”

李偉相信基因編輯技術具有重要臨床應用前景,談及基因編輯的安全性問題,他說:“任何生物技術,包括基因編輯技術在內,在臨床的應用都需要經過嚴格的安全性和有效性評估,過度的樂觀和輕易的悲觀都是不利于其發展的,需要足夠的耐心和毅力來制定嚴格的安全性和有效性評估標準并完成它。”

“基因編輯技術的安全性一直是臨床試驗不能回避的問題,在將基因編輯應用于臨床試驗之前,必須確定其安全性和有效性。”劉光慧說:“從積極的方面看,該論文再一次敲響了警鐘,提醒人們要嚴格評估任何一種臨床治療方案的安全性。其實,這對于從事基因編輯研究的科研人員來說更多的是一種激勵。”

基因編輯技術的價值主要體現在科學研究上,人們可以用來分析基因編輯發生的頻率、大小、脫靶現象等。可以在實驗動物、模式生物、微生物上進行反復研究,得出脫靶的規律。基因矯正則是基因編輯技術進一步發展、優化的結果。它的典型特點是切割位點單一、高效,可以在臨床上對致病基因進行矯正,徹底消除致病基因。基因矯正技術不僅僅采用基因編輯技術,也包括對在基因的功能層面進行干預和調節。